比特派app下载安装|氨苄青霉素抗性基因
作者： 比特派app下载安装
2024-03-07 22:30:18
常见抗性筛选浓度、原理及抗性基因序列 - 知乎
常见抗性筛选浓度、原理及抗性基因序列 - 知乎首发于生物实验方法类切换模式写文章登录/注册常见抗性筛选浓度、原理及抗性基因序列小林脾气不好原核氨苄青霉素Ampicillin、卡那霉素kanamycin、氯霉素chloramphenicol、壮观霉素Spectinomycin、四环素 tetracycline、博来霉素Zeocin/blemycin、链霉素Streptomycin、潮霉素Hygromycin、庆大霉素Gentamicin、硫酸安普霉素Apramycin sulfate、红霉素Erythromycin、诺尔斯菌素Nourseothricin真核G418 Neomycin、嘌呤霉素 Puromycin、潮霉素B HygromycinB、博来霉素 Zeocin/bleomycin、诺尔斯菌素Nourseothricin具体作用机理及其抗性基因序列G418（Geneticin,遗传霉素）作用机理：G418的结构独特之处在于其C6位置具有一个羟基功能而不是氨基功能。这种差异使其能够特异性地结合到80S核糖体复合物，与核糖体结合不可逆地抑制蛋白质合成，导致蛋白质翻译提前终止或错误翻译。耐药机理：当neo基因被整合进真核细胞DNA后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA ,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达。氨基糖苷磷酸转移酶能作用于氨基糖的特定羟基，使其磷酸化。从而抑制其与核糖体结合失去抗菌活力。抗性基因序列和kanR的一样，但是表达元件得用真核的
ATGGGTAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA酵母：0.25-0.5mg/mL，抗性压力筛选可往上调。不明来源的酵母以此为基础上调摇菌验证。细胞：200mg/mLAmp（ampicillin，氨苄青霉素）抗性基因序列
TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGGCTCCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCAT作用机理：青霉素属于β-内酰胺类抗生素，是作用于细菌细胞壁的抗生素。青霉素通过抑制细菌的转肽酶活性，发挥抑制细菌合成细胞壁的作用，从而杀灭细菌。细菌的细胞壁是包裹在细菌最外面的一层刚性结构，它决定着细菌的形状，保护细菌不因内部的高渗透压而破裂。细菌细胞壁的主要成分是黏肽，是具有网状结构的含糖多肽。细菌在合成细胞壁的过程中，需要黏肽转肽酶的催化。青霉素的作用就是抑制黏肽转肽酶，使其不能催化转肽反应，从而阻碍细菌合成细胞壁，进而导致细菌死亡。耐药机理：β-内酰胺酶（β-lactamase）可以将氨苄结构中的四元内酰胺环β-内酰胺（β-lactam）水解。携带bla基因的质粒转入大肠后，大肠杆菌表达β-内酰胺酶，在有氨苄西林的环境下生存下来。β-内酰胺酶分泌到细胞外后随着细菌的生长，培养基中的β-内酰胺酶会不断增加，培养基重的氨苄西林被降解，周围会长出卫星菌落，属于正常现象。大肠：100mg/mLKan（Kanamycin，卡那霉素）抗性基因序列和G418的一样，但是表达元件得用原核的
ATGGGTAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA大肠：100mg/mLzeocin（博莱霉素）作用机理： Zeocin 可通过嵌入和裂解 DNA 来导致细胞死亡。 耐药机理：由 Shble基因产物实现对 Zeocin 的耐受性，它可结合抗生素，防止其结合 DNA。大肠：25-50μg/mL(低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L)；酵母：50-300ug/mL 细胞：50-1000ug/mLTet（Tetracycline，四环素）tetR sequence
ttagaaatccctttgagaatgtttatatacattcaaggtaaccagccaactaatgacaatgattcctgaaaaaagtaataacaaattactatacagataagttgactgatcaacttccataggtaacaacctttgatcaagtaagggtatggataataaaccacctacaattgcaatacctgttccctctgataaaaagctggtaaagttaagcaaactcattccagcaccagcttcctgctgtttcaagctacttgaaacaattgttgatataactgttttggtgaacgaaagcccacctaaaacaaatacgattataattgtcatgaaccatgatgttgtttctaaaagaaaggaagcagttaaaaagctaacagaaagaaatgtaactccgatgtttaacacgtataaaggacctcttctatcaacaagtatcccaccaatgtagccgaaaataatgacactcattgttccagggaaaataattacacttccgatttcggcagtacttagctggtgaacatctttcatcatataaggaaccatagagacaaaccctgctactgttccaaatataattcccccacaaagaactccaatcataaaaggtatatttttccctaatccgggatcaacaaaaggatctgttactttcctgatatgttttacaaatatcaggaatgacagcacgctaacgataagaaaagaaatgctatatgatgttgtaaacaacataaaaaatacaatgcctacagacattagtataattcctttgatatcaaaatgaccttttatccttacttctttctttaataatttcataagaaacggaacagtgataattgttatcataggaatgagtagaagataggaccaatgaatataatgggctatcattccaccaatcgctggaccgactccttctcccatggctactatcgatccaataagaccaaatgctttacccctattttcctttggaatatagcgcgcaactacaaccattacgagtgctggaaatgcagctgcaccagccccttgaataaaacgagccataataagtaaggaaaagaaagaatggccaacaaacccaattaccgacccgaaacaatttattataattccaaataggagtaaccttttgatgcctaattgatcagatagctttccatatacagctgttccaatggaaaaggttaacataaaggctgtgttcacccagtttgtactcgcaggtggtttattaaaatcatttgcaatatcaggtaatgagacgttcaaaaccatttcatttaatacgctaaaaaaagataaaatgcaaagccaaattaaaatttggttgtgtcgtaaattcgattgtgaataggatgtattcac作用机理：四环素类抗生素通过与细菌胞内核糖体 30S亚基形成可逆结合体，抑制蛋白质合成，起到抗菌效果。当抗生素浓度较低时，这种可逆的竞争性结合也将失去作用，细菌的蛋白质合成将继续进行。四环素还可通过结合线粒体70S亚基，抑制线粒体蛋白质的合成。四环素与真核细胞核糖体80S亚基的结合能力相对较弱，因此抑制真核细胞蛋白质合成的能力也较弱。这可能是四环素抗菌作用能力强，而对人类副作用小的原因。大肠，枯草：50-100ug/mL氨基糖苷抗生素[1] 是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素。有来自链霉菌的链霉素等、来自小单孢菌的庆大霉素等天然氨基糖苷类，还有阿米卡星等半合成氨基糖苷类。抗性基因序列aph(4)-Ia
ttattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtcggtttccactatcggcgagtacttctacacagccatcggtccagacggccgcgcttctgcgggcgatttgtgtacgcccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatcgaccctgcgcccaagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaagctctgatagagttggtcaagaccaatgcggagcatatacgcccggagccgcggcgatcctgcaagctccggatgcctccgctcgaagtagcgcgtctgctgctccatacaagccaaccacggcctccagaagaagatgttggcgacctcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgtccgtcaggacattgttggagccgaaatccgcgtgcacgaggtgccggacttcggggcagtcctcggcccaaagcatcagctcatcgagagcctgcgcgacggacgcactgacggtgtcgtccatcacagtttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgcatatgaaatcacgccatgtagtgtattgaccgattccttgcggtccgaatgggccgaacccgctcgtctggctaagatcggccgcagcgatcgcatccatggcctccgcgaccggctgcagaacagcgggcagttcggtttcaggcaggtcttgcaacgtgacaccctgtgcacggcgggagatgcaataggtcaggctctcgctgaattccccaatgtcaagcacttccggaatcgggagcgcggccgatgcaaagtgccgataaacataacgatctttgtagaaaccatcggcgcagctatttacccgcaggacatatccacgccctcctacatcgaagctgaaagcacgagattcttcgccctccgagagctgcatcaggtcggagacgctgtcgaacttttcgatcagaaacttctcgacagacgtcgcggtgagttcaggctttttacccat链霉素（streptomycin）作用机理：可以与核酸强结合，干扰和阻断蛋白质合成，同时允许继续合成 RNA 和 DNA 。耐药机理：阳性转化子转入磷酸转移酶（aminoglycoside phosphotransferase）基因（如：aph(4)-Ia），并进行表达后。磷酸转移酶能作用于氨基糖的特定羟基，使其磷酸化。如卡那霉素激酶(编号：EC 2.7.1.95)催化ATP的γ磷酸转移至卡那霉素3′-羟基，产生3′-磷酸卡那霉素，也可作用于庆大霉素、新霉素等氨基糖苷抗生素，从而抑制其与核糖体结合失去抗菌活力。低拷贝载体用25 mg/L；高拷贝载体用50 mg/L；菌株筛选用50 mg/L壮观霉素（Spectinomycin）SmR
aminoglycoside adenylyltransferase (Murphy, 1985)
ATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAA作用机理：与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成。氨基糖苷类抗生素，常用其盐酸盐形式。耐药机理：氨基糖苷-3′-腺苷酸转移酶(aminoglycoside 3′-adenylyltransferase)能够通过腺苷酰化灭活壮观霉素和链霉素,并阻止其与核糖体结合,从而使转化植株具有壮观霉素和链霉素抗性工作浓度：7.5-20 ug/mL对于低拷贝质粒建议选择浓度下限，高拷贝质粒选择浓度上限。诺尔斯菌素（Nourseothricin）nat1 sequence 573bp
atgggtaccactcttgacgacacggcttaccggtaccgcaccagtgtcccgggggacgccgaggccatcgaggcactggatgggtccttcaccaccgacaccgtcttccgcgtcaccgccaccggggacggcttcaccctgcgggaggtgccggtggacccgcccctgaccaaggtgttccccgacgacgaatcggacgacgaatcggacgacggggaggacggcgacccggactcccggacgttcgtcgcgtacggggacgacggcgacctggcgggcttcgtggtcgtctcgtactccggctggaaccgccggctgaccgtcgaggacatcgaggtcgccccggagcaccgggggcacggggtcgggcgcgcgttgatggggctcgcgacggagttcgcccgcgagcggggcgccgggcacctctggctggaggtcaccaacgtcaacgcaccggcgatccacgcgtaccggcggatggggttcaccctctgcggcctggacaccgccctgtacgacggcaccgcctcggacggcgagcaggcgctctacatgagcatgccctgcccctaa作用机理：代谢产生的一种广谱型抗生素，因结构上具链丝菌素（Streptothricin，STs）化学基团，故归属于此类抗生素亚家族。天然产物提取的诺尔斯菌素（Nourseothricin）一般为ST-F和ST-D的混合物，具有极其宽广的抑制生长活性，原核生物如细菌；真核生物如包括白色念球菌在内的各种酵母菌、丝状真菌、原生生物、昆虫和植物。诺尔斯菌素的作用机制是通过诱导mRNA错误编码，来抑制蛋白合成。耐药机理：nat1最初从S. noursei分离所得，此基因能编码表达诺尔斯菌素N-乙酰转移酶，通过对诺尔斯菌素（NTC）上与糖基部分相连的ß-赖氨酸上的ß-氨基基团进行单乙酰化修饰，使得抗生素失活。筛选浓度：大多数有机体的筛选浓度多在50-200µg/ml区间内。氯霉素（chloramphenicol）CmR chloramphenicol acetyltransferase
atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtctgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaa作用机理：细菌细胞的70S核糖体是合成蛋白质的主要细胞成分，它包括50S和30S两个亚基。氯霉素通过可逆地与50S亚基结合，阻断转肽酰酶的作用，干扰带有氨基酸的胺基酰-tRNA终端与50S亚基结合，从而使新肽链的形成受阻，抑制蛋白质合成。由于氯霉素还可与人体线粒体的70S结合，因而也可抑制人体线粒体的蛋白合成，对人体产生毒性。（做实验时请一定注意安全）耐药机理：氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicol Acetyltransferase ，CAT）是一种原核酶类，可以将氯霉素乙酰化而使其失活，是细菌产生氯霉素抗性的主要原因。储存液制备：称取1g氯霉素溶于20ml 100%乙醇充分溶解后得到50mg/ml的母液，0.22µM有机相滤膜过滤除菌后，分装成小量后-20°C冻存，避免反复冻融，一年有效。实际有效工作浓度为5-20µg/ml。参考^氨基糖苷类抗生素 https://www.yixue.com/%E6%B0%A8%E5%9F%BA%E7%B3%96%E8%8B%B7%E7%B1%BB%E6%8A%97%E7%94%9F%E7%B4%A0#.E9.93.BE.E9.9C.89.E7.B4.A0.EF.BC.88streptomycin.EF.BC.89编辑于 2023-12-01 14:41・IP 属地重庆信息筛选生物化学赞同 2435 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录生物实验
分子克隆——抗生素及其抗性基因的应用 - 知乎
分子克隆——抗生素及其抗性基因的应用 - 知乎首发于分子克隆切换模式写文章登录/注册分子克隆——抗生素及其抗性基因的应用BT 时代耐药性（drug resistance）这个名词，我相信绝大部分非专业人士也都听说过，它是指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于化疗药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。抗生素的环境污染已被提出作为一类新型环境污染物，长期使用抗生素导致出现了一些对现有的抗生素都不敏感的超级细菌如金黄色葡萄球菌等，我国养殖行业今年也已经开始饲料端全面禁抗。使用抗生素导致抗性基因大量出现的问题一直困扰着科学家们，但在基础研究领域，抗生素抗性基因却发挥着极为重要的正面作用。在谈抗生素抗性基因之前，我们必须得先聊聊这个虽然现在屡受诟病，但仍然是人类历史上一项不容置疑的伟大发现——抗生素。1928年，弗莱明（Alexander Fleming）博士在实验室发霉的培养基中（真菌周围不长细菌）偶然的发现了今天我们在生活中也经常提及的青霉素，这是人类发现的第一种抗生素。在青霉素发现之前，人类几乎没有什么办法可以对抗毒力较强的细菌感染性疾病，1347年在欧洲爆发的鼠疫夺走了欧洲近1/3的人口，耗费150年才恢复过来。而在1944年诺曼底登陆时，盟军携带的10万支青霉素拯救了无数的伤员，很大程度上避免了他们因为伤口感染而丧命。抗生素的发现彻底改变了人类对抗细菌的能力，所以也不难理解为什么1945年诺贝尔生理学或医学奖颁发给了弗莱明以及完成了青霉素提纯的弗洛里（Howard Walter Florey）和钱恩（Ernst Chain）这三位科学家。01 抗生素抗生素通常定义为可以杀死细菌或抑制其生长的试剂。虽然抗生素最初为自然产物，但现在实验室常用的抗生素多为半合成或全合成复合物。可根据抗生素是直接杀死细菌还是仅仅抑制细菌生长繁殖对抗生素进行分类，然而，这种分类方法具有灰色地带，因为只起抑菌作用的抗生素在高浓度下也会杀死细菌。抑菌和杀菌的区别可用抑制DNA复制和诱导DNA断裂的机制来理解，抑菌只能抑制细菌的繁殖，而杀菌则可以破坏细菌体生命活动所必须的物质而杀灭细菌。抗生素的工作浓度取决于不同菌株对其的耐受性程度，需要通过测定MIC值（最小抑菌浓度，minimal inhibitory concentration）来确定抗生素抑制细菌生长繁殖的最小药物浓度。下表列出了实验室常用抗生素的介绍，其中包含了大多数抗生素的类型及作用机制。实验室常用抗生素简介不特别说明，配置抗生素溶液时使用ddH2O溶解（EtOH：乙醇）02 抗生素抗性基因的运用抗生素抗性基因的存在使得细菌在抗生素存在的环境中也可以生长繁殖，现已成为分子生物学广泛使用的正筛工具。在不利用选择元件的情况下，质粒克隆存在两个以下两个问题：☞由于质粒转化到大肠杆菌中是一个相当低效率的过程，成功率只有1/10000，如果没有合适的方法快速筛选出成功的转化株，研究人员需要花费数小时甚至数天的时间寻找正确的单克隆；☞另外，质粒的存在对于细菌来说是不利的，含质粒的细胞除了复制它自己的基因组DNA，还需要耗费能量来复制质粒，正常情况下，由于质粒中携带的基因多为奢侈基因，并非是细菌生长繁殖所必需，所以在细菌繁殖过程中质粒可能会丢失或拷贝数降低。在质粒上插入一个抗性基因这两个问题立即得到解决，在含有相应抗生素的选择培养基中可以轻易的得到成功的转化株，并且抗生素的存在给了细菌一个不得不复制质粒的理由。过去，抗生素也被用来在染色体水平上干扰基因。在想要干扰或敲除基因的编码区引入一个抗性基因盒，这不仅使得基因失活，而且还可以作为一个选择标记。在设计这种实验时，突变和筛选最好利用不同的抗性基因。另外，抗性基因的丢失也可以作为成功克隆的一个选择标记。使用这种方法时，克隆载体通常含有两个独立的抗性基因盒，目的基因被克隆进入其中一个抗性基因盒使该抗性基因失活，或者使用Gateway克隆使整个抗性基因盒被移除，这样我们就可以直接选择只对另外一种抗生素（完整抗性基因盒对应的抗生素）有抗性的细菌。03 使用抗生素的注意事项1、大多数抗生素粉末状时稳定，溶液状态时易分解，应在-20℃储存，避免反复冻融，这样大多数抗生素在6个月内均可用。2、氨苄青霉素（Amp）分解速度快，含有Amp的平板培养基需在一个月内使用，使用时要防止产生卫星菌落。卫星菌落：指有些载体带有 -内酰胺酶的基因，表达出的 -内酰胺酶可以破坏氨苄青霉素。当细菌培养时间过长， -内酰胺酶积累过多，就会使氨苄青霉素失效，导致不含质粒的空菌落大量生长，这就是卫星菌落。由于生长时间较短，所以卫星菌落一般较小，星状分布，环绕在中心菌落周围，卫星菌落由此得名。在克隆过程中挑取较大的中心克隆一般对结果不会有什么影响。来源：360百科3、羧苄青霉素（CB）比氨苄青霉素稳定，大多数情况下可代替Amp4、抗生素对热和光的敏感度不同，禁止将抗生素加到温度高于55℃的培养基中；如果抗生素对光敏感，应用锡纸包裹、避光保存。5、一些大肠杆菌菌株本身就含有抗性基因，使用时应确保质粒和菌株是相容的（若基因组和质粒中含有相同的抗性基因，在进行抗生素选择时达不到选择效果，且细菌可能会优先利用基因组DNA的抗性基因而舍弃质粒）。参考书籍：Plasmids 101:A Desktop Resource——Created and compiled by Addgene March 2017（3rd Edition）点击下方链接查看原文欢迎大家关注我的个人公众号【BT 时代】编辑于 2020-03-19 12:28赞同 222 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录分
氨苄筛选为什么不靠谱？ - 知乎
氨苄筛选为什么不靠谱？ - 知乎首发于BioEngX切换模式写文章登录/注册氨苄筛选为什么不靠谱？于浩然Protein Engineer做分子生物的同学肯定对氨苄西林（Ampicillin）并不陌生。在大肠杆菌及其他细菌中进行基因克隆与蛋白表达的时候，这种广谱抗生素是最常用的选择标记之一。为了保证实验的成功，在注意操作的同时，大家有没有怀疑过自己使用的那些所谓靠谱的技术呢？就比如氨苄西林筛选。很多人循规蹈矩地做着这个实验，但发现质粒里往往没有自己的目标序列，或是产量很低。很有可能是你的选择标记已经失效了！通过这篇文章，小编会给大家讲讲氨苄筛选的工作原理和实验技巧，让你在表达蛋白的时候有个更好的开端。首先，让我们简单的了解一下氨苄筛选的基本原理。氨苄西林是一种广谱抗生素（结构如上图所示），可以杀死多种革兰氏阴性菌或是阳性菌。但是它也有自己怕的东西，那就是β-内酰胺酶（β-lactamase）。这种酶可以将氨苄结构中的四元内酰胺环β-内酰胺（β-lactam）水解，使其失去药性。基于这一特点，经过特殊设计的质粒都携带bla基因。转化成功的细菌会携带这种基因，从而表达β-内酰胺酶，在有氨苄西林的环境下生存下来。但是现在问题来了：细菌产生的β-内酰胺酶是会分泌到细胞外的。随着细菌的生长，培养基中的β-内酰胺酶会不断增加，这时培养基内氨苄西林会被降解，浓度降低。筛选压力一旦消失或是变弱， 不带有抗性质粒的细菌，就有了可乘之机。不知道大家在实验过程中是否会遇到过卫星菌落的现象？琼脂板培养时间过长时，会发现一个大菌落的周围会出现一些小的卫星菌落。卫星菌落是如何形成的呢？这是因为阳性克隆分泌了β-内酰胺酶，并在其周围积累聚集，降解了这个区域的抗生素，因此没有此质粒的小菌群则环绕而生。使用氨苄青霉素会产生的另一个问题是质粒丢失。细菌在传代的时候，会出现质粒丢失，传代次数越多，质粒丢失的可能性越大。对于其他抗生素如氯霉素，细菌如果丢失了部分带抗性的质粒，该菌在含有氯霉素的培养基中是不会生长的。但是对于氨苄则不然，在液体培养液中，培养时间过长的培养基中抗生素的浓度会降低，丢失了一部分质粒的细菌也可以在其中生长。因此对于使用氨苄作为抗性标记的克隆，每隔一段时间需要检查细菌质粒丢失情况。比较直观的办法就是通过SDS-PAGE，如果发现蛋白质的表达水平降低了，很大可能是因为质粒丢失了。这时候需要重新转化重组载体。说了这些缺点之后，大家是不是有点灰心了。小编根据自己的实验经验和网上信息，总结了以下几个方法，来克服氨苄筛选的缺点，希望能帮助到大家！如果你有更好的办法，也欢迎评论分享你的经验。在液体培养中，不要让细胞长到饱和，在LB培养基内，OD600绝对不能超过3；如果是扩大培养，可以先把初始培养液内细胞沉淀，然后利用新鲜的培养液重悬，再进行下一步的培养，这样可以大大减少β-内酰胺酶在液体中的含量；使用高浓度的氨苄西林，例如 200µg/mL; 这样β-内酰胺酶很难分解掉所有的氨苄西林，对预防卫星菌落很有效；不要使用配制时间过长的氨苄溶液。氨苄存储时间过长或者保存不当，很有可能发生降解。建议新配制的溶液分装保存，减少冻融的次数；如果还是不行的话，就试试羧苄青霉素（Carbenicillin）。这个和氨苄筛选的工作原理很像，分解的速度相较于氨苄西林更慢，但也更贵。如果你对分子克隆感兴趣，可以加入我们 BioEngX-PCR与分子克隆讨论群，小编的微信号是bioengxadmin编辑于 2017-04-15 05:09分子生物学克隆（分子克隆）生物技术赞同 19545 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录BioEngX活跃在移动端的无国界
什么是标记基因？ - 知乎
什么是标记基因？ - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册基因克隆（分子克隆）质粒质粒构建质粒载体什么是标记基因？关注者3被浏览437关注问题写回答邀请回答好问题添加评论分享2 个回答默认排序维真生物已认证账号 关注按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。选择标记用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来；筛选标记用于将特殊表型的重组子挑选出来。（一） 选择标记抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。1．氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） 氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化 β-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。青霉素是一类化合物的总称，其分子结构由侧链 R-CO- 和主核 6-氨基青霉烷酸（6-APA）两部分组成。在 6-APA 中有一个饱和的噻唑环（A）和一个 β-内酰胺环， 6-APA 为由 L- 半脱氨酸和缬氨酸缩合成的二肽。 2．四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） 四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。3．氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） 氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性 P1 噬菌体（也携带 Tn9）。cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶 A 存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。4．卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr,neor） 卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3'）-Ⅱ, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。5．琥珀突变抑制基因 supF 在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变（突变为 UAG），或乳白突变（突变为 UGA）。 supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和 ampr 基因，只有当宿主含有 supF 基因时才会对 Amp 和 Tet 具有抗性。相应的， supE 基因在UAG 密码子上编译谷氨酰氨。由于目前所用的标记基因使用方便，因此用这类标记的载体较少。6．其它 还有一些正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。（二）筛选标记 筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。1．α-互补（α-complementation） α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的 lacZ 基因编码 β-半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的 β-半乳糖苷酶。例如，lacZ△M15 基因是缺失了编码 β-半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因，无酶学活性。对于只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基因（称为 lacZ'），其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复 β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。 2．插入失活 通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源 DNA 片段插入tetr 基因后，导致 tetr 基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。山东维真生物科技有限公司可为您提供腺病毒、慢病毒及腺相关病毒(AAV)的质粒设计、载体构建、病毒包装、细胞系建立至表达分析的全套服务。如果您有需求，欢迎致电垂询(400-0772566)或添加微信客服（13012994257）。关注微信公众号“维真生物”，了解更多产品/服务或活动详情!发布于 2024-01-15 09:09赞同添加评论分享收藏喜欢收起高中生物首都师范大学 生物学硕士 关注构建基因的表达载体的时候加上标记基因，是为了便于筛选。发布于 2024-01-16 21:02赞同添加评论分享收藏喜欢收起
氨苄青霉素的广泛应用可能被冤枉？全基因组测序为她洗刷冤屈 _研究
氨苄青霉素的广泛应用可能被冤枉？全基因组测序为她洗刷冤屈 _研究
新闻
体育
汽车
房产
旅游
教育
时尚
科技
财经
娱乐
更多
母婴
健康
历史
军事
美食
文化
星座
专题
游戏
搞笑
动漫
宠物
无障碍
关怀版
氨苄青霉素的广泛应用可能被冤枉？全基因组测序为她洗刷冤屈
2020-01-22 09:29
来源:
派森诺
原标题：氨苄青霉素的广泛应用可能被冤枉？全基因组测序为她洗刷冤屈
氨苄西林（Ampicillin）是第一种半合成青霉素，于1961年上市销售，主要用于对抗肠杆菌科病原菌。1962年和1964年，在英国出现了首次由肠道血清型鼠伤寒沙门氏菌引起的疾病暴发，该菌对氨苄西林耐药。氨苄青霉素是迄今为止使用最广泛的抗生素之一，被广泛认为其使用可能是耐药型鼠伤寒沙门氏菌抗原分离株出现的主要推手。为了解氨苄青霉素抗性菌株出现的原因，研究人员筛选了大量肠道血清型鼠伤寒沙门氏菌的历史分离株，目标是追溯这种鼠伤寒沙门氏菌分离株耐药性出现的踪迹。
研究结果被发表在《Lancet Infectious Diseases》（影响因子19.864）上，研究结果表明，抗生素的使用与病原菌耐药选择性之间的关联可能并不像通常想象的那样直接。
研究方法：
研究分析了于1911年至1969年收集的来自四大洲31个国家包括来自人类，动物，饲料等多种来源的共288株肠道血清型鼠伤寒沙门氏菌。研究通过全基因组测序、抗微生物药物敏感性测试，抗性转移实验等手段，深入研究氨苄青霉素抗性的群体结构和机制。
测序平台：Illumina HiSeq、Pacbio RSⅡ平台
研究结果：
1、 抗菌素药物敏感测试
对从多种来源分离的288株鼠伤寒沙门氏菌进行抗菌素药敏试验，结果表明有11个分离株（4%）对氨苄西林有抗性，其中的7株同时对其他抗菌药物如磺胺类、甲氧苄胺嘧啶、四环素等有抗性。氨苄西林耐药菌同时具有产生β-内酰胺酶的能力（图1）。11株氨苄西林耐药菌中，出现频率最高的β-内酰胺酶基因blaTEM-1B由转座子Tn2携带，位于不相容质粒组lncF和lncX1上（表1）。
图1 各年份具氨苄西林抗性和β-内酰胺酶合成能力分离株数量图
展开全文
表1 11株抗氨苄西林鼠伤寒沙门氏菌分离株特征
2、 Tn2转座子整合位点研究
对Tn2转座子接头序列的研究结果表明，以lncF质粒pSLT为例，Tn2转座子在不同菌株中有3个整合位点。如图2，红色框代表包含Tn2转座子的基因，黄色框代表抗生素抗性基因。将11个氨苄西林抗性鼠伤寒沙门氏菌分离株与STM 36-57 NalR受体菌株杂交能够建立携带bla基因的不同质粒的可转移性，结果显示携带blaTEM基因质粒的9个分离株可以通过接合过程转移氨苄青霉素抗性。
图2 质粒pSLT中Tn2转座子整合位点示意图
3、 基于全基因组SNP进行系统发育分析
基于全基因组32741个SNPs构建发育树，结果显示11株氨苄西林抗性鼠伤寒沙门氏菌分离株被分为三组（如图3）。
图3 鼠伤寒沙门氏菌分离株系统发育树（Maximum-likelihood）
结论
在研究人员收集的288株鼠伤寒沙门氏菌分离株中，有11株（4％）分离株由于携带了β-内酰胺酶基因及blaTEM-1基因或毒性质粒，从而获得了对氨苄青霉素的抗性。这11个抗氨苄青霉素分离株来自三个不同的系统发生组。结果表明，肠道血清型鼠伤寒沙门氏菌的氨苄青霉素抗性传播性在1961年销售前已经出现，氨苄青霉素作为第一种用于治疗肠杆菌科病原菌感染的广谱青霉素，不太可能导致早期的氨苄西林抗性分离株的选择出现。
文章索引
Alicia Tran-Dien, Simon Le Hello, Christiane Bouchier, et al. Early transmissible ampicillin resistance in zoonotic Salmonella enterica serotype Typhimurium in the late 1950s: a retrospective, whole-genome sequencing study. Lancet Infectious Diseases, Volume 18, No.2, p207–214, February 2018返回搜狐，查看更多
责任编辑：
转载自原创文章：
平台声明：该文观点仅代表作者本人，搜狐号系信息发布平台，搜狐仅提供信息存储空间服务。
阅读 ()
推荐阅读
常见抗生素和抗性基因的工作原理是什么啊？ - 知乎
常见抗生素和抗性基因的工作原理是什么啊？ - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册基因基因工程抗生素基因进化常见抗生素和抗性基因的工作原理是什么啊？抗生素和抗性基因的工作原理有没有大佬整理过啊。 比如氨苄青霉素、奇霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素是如何杀死细菌的，带有抗性基因的菌体又是通过何种方式免…显示全部 关注者4被浏览9,518关注问题写回答邀请回答好问题添加评论分享2 个回答默认排序橙子清夜无尘，月色如银。酒斟时，须满十分。 关注图片为转载，侵私聊我删除至于为什么抗性基因可以帮助宿主抵抗抗生素，我在百度上搜到这个答案，不确定真实与否。细菌抗药性产生有几种原理 1 分解抗生素，如抗贝塔内酰胺类的抗生素基因，是产生一种能够分解抗生素的酶 2 将抗生素运出细胞，比如LMRA基因可以产生一种将林可霉素运出细胞外的酶 3 阻断与抗生素的作用位点，如将某个位点进京修饰使得抗生素难以识别等发布于 2022-05-29 16:52赞同 52 条评论分享收藏喜欢收起YouTube精选字幕译制外文精品视频，每日分享英语视频 关注抗生素是如何杀死病毒的7599 播放 · 4 赞同发布于 2023-07-06 14:07· 224 次播放赞同添加评论分享收藏喜欢收起
抗生素抗性基因_百度百科
性基因_百度百科 网页新闻贴吧知道网盘图片视频地图文库资讯采购百科百度首页登录注册进入词条全站搜索帮助首页秒懂百科特色百科知识专题加入百科百科团队权威合作下载百科APP个人中心收藏查看我的收藏0有用+10抗生素抗性基因播报讨论上传视频使细菌对氨基苄青霉素、氯霉素等抗生素产生抗性抗生素抗性基因：使细菌对氨基苄青霉素，氯霉素等抗生素产生抗性。在一个细菌群体中，不是所有的个体都有该基因。因为这种基因往往是通过基因突变产生，所以基因频率较低。中文名抗生素抗性基因外文名Antibiotics resistance genes目录1简介2来源3背景介绍4调查背景5建议简介播报编辑抗生素抗性基因抗生素的环境污染与生态毒性近年来引起了日益广泛的关注.水产养殖和畜牧业抗生素长期滥用的直接后果,很可能诱导动物体内抗生素抗性基因,经排泄后将对养殖区域及其周边环境造成潜在基因污染.抗性基因还极有可能在环境中传播、扩散.对公共健康和食品、饮用水安全构成威胁.为此,提出了将抗生素抗性基因作为一类新型环境污染物,对该类污染物在环境中的来源、潜在的传播途径以及国内外相关研究进展进行综述,指出了当前形势下中国开展环境中抗生素抗性基因污染研究的必要性,建议尽快从国家层面上系统进行抗生素抗性基因的环境污染机理与控制对策研究。来源播报编辑近年来，由于抗生素的滥用首先诱导动物体内产生抗生素抗性基因(Antibiotics resistance genes,，ARGs)，从而加速了抗性基因在环境中细菌间的传播扩散，目前，抗生素抗性基因作为一类新型环境污染物，在不同环境介质中的传播、扩散可能比抗生素本身的环境危害更大，抗生素抗性基因在地表水、地下水、医疗废水、城市污水处理厂、养殖场、土壤、沉积物以及大气环境中都有分布、传播情况。光照，厌氧，高温处理可以有效遏制抗生素抗性基因在环境中的传播和扩散，抗生素抗性基因也可能造成的生态风险。背景介绍播报编辑卡那霉素抗性基因（nptII）对卡那霉素具有抗性，四环素抗性基因（tetR）对四环素具有抗性。转基因研究过程中一般会使用标记基因，而使用抗生素抗性基因作为标记一直存在争议。目前，被广泛应用的抗生素类标记基因包括新霉素磷酸转移酶基因（npt），卡那霉素抗性基因（nptII）等。但是，抗生素抗性标记基因潜在的食用安全性一直存有争议，有研究表明转基因食品中的抗生素抗性基因可能通过转染肠道细菌，从而造成人类对这些抗生素产生抗性，也就是耐药性。抗生素抗性会导致人类或动物药品中抗生素使用失效，一直以来是影响全球公众健康的重要问题。2003年，联合国粮食和农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合颁布的转基因植物食品风险评估准则第58条指出：“对在临床上应用的抗生素具有抗性的耐抗生素基因不应在食品中出现”。欧盟决定从2004年起禁止使用耐抗生素标记的基因。2007年，世界卫生组织(WHO)根据药用重要性将卡那霉素、新霉素和四环素列为第二级别，为重要类抗生素，意味着卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因等这类抗生素抗性基因不应在食品中出现。欧盟药品管理局(EMEA)认同世界卫生组织(WHO)的观点，指出卡那霉素应该被列为在医疗上有重要作用的药品一类。因此，这类抗生素抗性基因不应出现在市场上或者田间试验的转基因植物中。调查背景播报编辑2009年2月至3月间，绿色和平随机对超市所销售木瓜的转基因成分检测发现：国产木瓜均为转基因木瓜。虽然农业部只批准转基因木瓜在广东省商业化种植，绿色和平在4月的实地调查和检测却发现海南岛也存在非法种植转基因木瓜的情况。转基因木瓜的食品安全性一直备受争议，日本政府也出于安全性考虑至今未批准美国转基因木瓜的进口许可。有多种转基因木瓜研究时都采用抗生素抗性基因作为标记基因，而食品中出现抗生素抗性基因可能会对健康构成风险。因此，绿色和平决定对市场销售的木瓜基因抗生素抗性基因进行检测。建议播报编辑绿色和平的调查发现，市场出现的转基因木瓜含有抗生素抗性基因，而且已经进入食物链，食用这些木瓜可能使消费者对部分抗生素产生抗性，从而威胁消费者健康。绿色和平呼吁相关政府部门立即召回市场上所有的转基因木瓜，重新评估并调整转基因。木瓜生产的部署。绿色和平也建议相关政府部门严格遵循《卡塔赫纳生物安全议定书》，以预先防范的原则处理转基因生物对环境和人体健康带来的风险；立即评估含抗生素抗性基因转基因木瓜对消费者健康带来的危害；进一步完善转基因生物安全评价体系；严禁在转基因研究中使用抗生素抗性基因作为标记基因使用。目前，中国正在考虑批准转基因水稻的商业化生产，鉴于转基因作物对健康的影响仍然存在争议，而此次转基因木瓜检测出抗生素抗性基因再次给转基因食品安全问题敲响警钟。水稻是中国13亿人的主粮，转基因粮食作物安全事关重大，绿色和平也建议农业部及相关部门暂停任何转基因水稻商业化种植的进程，并将更多资金投入到已经被证实安全高产的生态农业的推广上。新手上路成长任务编辑入门编辑规则本人编辑我有疑问内容质疑在线客服官方贴吧意见反馈投诉建议举报不良信息未通过词条申诉投诉侵权信息封禁查询与解封©2024 Baidu 使用百度前必读 | 百科协议 | 隐私政策 | 百度百科合作平台 | 京ICP证030173号 京公网安备110000020000cDNA Libraries and cDNA Library Construction - Getting Started | Thermo Fisher Scientific - PH
cDNA Libraries and cDNA Library Construction - Getting Started | Thermo Fisher Scientific - PH
Hamburger Menu Button
Thermo Fisher Scientific Logo
Sign in
Don't have an account ?
Create Account
Products
Antibodies
Cell Culture Media
Chemicals
Western Blot Products
Chromatography Columns and Cartridges
Lab Equipment
Lab Plasticware and Supplies
Microplates
Oligos, Primers, Probes and Genes
TaqMan Real-Time PCR Assays
Greener Products
See all product categories
Applications
Bioprocessing
Cell Culture and Transfection
Food and Beverage
Lab Solutions
Pharma and Biopharma
Real-Time PCR
Semiconductor Analysis
Clinical and Diagnostics
Digital Solutions
Spectroscopy, Elemental and Isotope Analysis
See all applications and techniques
Services
CDMO and Clinical Trial Services
Custom Services
Enterprise Services
Financial and Leasing Services
Instrument Services
Lab Informatics
OEM and Commercial Supply
Training Services
See all services
Help and Support
How to Order
Instrument Support
Learning Centers
Register for an Account
Technical Support Centers
See all help and support topics
Popular
TaqMan Real-Time PCR Assays
Antibodies
Oligos, Primers & Probes
GeneArt Gene Synthesis
Cell Culture Plastics
Contact Us
Quick Order
Order Status and Tracking
Documents and Certificates
Thermo Fisher Scientific Logo
Search
Thermo Fisher Scientific
Search All
Search
Search button
Search button
Close
Order Status
Quick Order
Sign in
Sign in
Don't have an account ?
Create Account
Account
Check Order Status
Custom Products & Projects
Instrument Management
Home›Support Centers›PCR and cDNA Synthesis Support Center›cDNA Libraries and cDNA Library Construction Support›cDNA Libraries and cDNA Library Construction - Getting StartedcDNA Libraries and cDNA Library Construction - Getting StartedSee Navigation‹cDNA Libraries and cDNA Library Construction SupportcDNA Libraries and cDNA Library Construction - Getting Started
›cDNA Libraries and cDNA Library Construction - Troubleshooting
›Find valuable information.Optimize your experiments to get the best results. We’ve compiled a detailed knowledgebase of the top tips and tricks to meet your research needs.View the relevant questions below:Having problems with your experiment? Visit ourTroubleshooting pageBrowse our FAQ database for more information ›
cDNA Library Construction Kits
What kit would you recommend for making cDNA libraries?
We would recommend using the CloneMiner™ II cDNA Library Construction Kit (Cat. No. A11180) for construction of high-quality Gateway cloning-compatible cDNA libraries without the use of restriction enzyme cloning. This system uses highly efficient recombinational cloning, resulting in a higher number of primary clones compared to standard cDNA library construction methods.
Can you obtain a better representation of complete cDNAs if you use the random primers or oligo(dT) primers in the first-strand cDNA synthesis step for cDNA library construction?
First-strand cDNA synthesis is most commonly primed using oligo(dT) or modifications of this sequence (such as primer-adapters) that bind to the poly(A) tail of mRNA. This priming method offers two major advantages: only poly(A)+ RNA is copied, and most cDNA clones begin at the 3’ terminus of the mRNA.At the same time, oligo(dT) priming has certain limitations—some cDNA clones may not be full length (due to RNA secondary structure or pausing by reverse transcriptase) also, poly(A)- mRNA cannot be copied.An alternative method is to use random hexamers, which, in theory, are capable of binding and priming throughout virtually any RNA template. Random hexamers, which may be used either by themselves or in combination with oligo(dT), have been instrumental in producing cDNAs containing more 5’ information than those primed with oligo(dT) alone. In addition, random hexamers can be used to generate cDNA libraries from poly(A)- mRNA and single-stranded viral RNAs.
What are the benefits of using the Gateway system in your CloneMiner™ II cDNA Library Construction Kit?
Gateway entry clone cDNA libraries are ready to transfer into suitable destination vectors for gene expression. You do not have to worry about restriction enzyme digestion of cDNA (which can decrease the insert size,) or vector prior to cloning.
What is the difference between your discontinued CloneMiner™ and the CloneMiner™ II cDNA Library Construction Kit?
The CloneMiner™ II kit offers the following improvements:SuperScript III RT instead of SuperScript II RTBP Clonase II Enzyme Mix instead of BP Clonase Enzyme MixSimplified cDNA fractionation protocol with no radioactive labeling of cDNA and 3 fractions collected
Can Gateway pDONR™221 be used instead of pDONR™ 222 to clone cDNA with CloneMiner™ II cDNA Library Construction Kit?
This is not recommended. pDONR™ 222 has the kan gene in the opposite orientation. This has been empirically noted to increase the transformation efficiency, which is needed to target the highest primary titer possible.
Can I purchase the pDONR™ 222 vector separately?
No, the pDONR™ 222 vector is not available as a standalone vector. However, it can be propagated in OneShot ccdB Survival™ 2 T1R cells. After propagation, it is important to check that the ccdB gene has not been lost during propagation. Perform a comparative colony count between the propagated pDONR™ 222 transformed into ccdB Survival™ 2 T1R cells and TOP10 cells (or another sensitive strain). There should be 10,000x more cells when transformed into ccdB Survival™ 2 T1R cells.
Can I use chemically competent cells with the CloneMiner™ II cDNA Library Construction Kit?
We do not suggest using chemically competent cells. There may be as much as a 100-fold reduction in the number of primary clones if chemically competent cells are used.
Is it necessary to precipitate the DNA following the BP Clonase II reaction during cDNA library construction with my CloneMiner™ II cDNA Library Construction Kit?
Yes, we strongly recommend precipitating the DNA to avoid arcing with the electrocompetent cells following the BP Clonase II reaction. The precipitated DNA can be resuspended in water instead of TE.
I have a small amount of starting mRNA. What kit do you recommend for library construction?
The CloneMiner™ II cDNA Library Construction Kit is recommended for nanoquantity libraries. A smaller amount of mRNA down to 50 ng can be used to construct nanoquantity libraries containing 105–106 primary clones.
Do you still offer the SuperScript Full length cDNA Library Construction Kit?
The SuperScript Full length cDNA Library Construction Kit has been discontinued. The alternative is the CloneMiner™ II cDNA Library Construction Kit, Cat. No. A11180.
Gene Pool™ cDNA
How was Gene Pool™ cDNA made?
Gene Pool™ cDNA was made using M-MLV reverse transcription at 42°C.
What methods are used in generating Gene Pool™ cDNA to ensure that the full-length gene is synthesized?
The key to generating full-length cDNA is to start with high-quality, intact RNA and to use the highest quality reagents in reverse transcription. All RNA used to synthesize Gene Pool™ cDNA is purified using pre-qualified reagents. After purification the RNA is treated with DNase to eliminate contaminating DNA which can lead to spurious bands when performing PCR. The cDNA is further analyzed for purity by UV spectrophotometry. To guarantee the quality of reverse transcription, each reaction is verified by amplifying fragments of the actin and clathrin housekeeping genes. The 5´ end of the 6 kb clathrin transcript must be successfully amplified for the cDNA to meet our strict quality standards. The ability to PCR amplify the 5´ end of the 6 kb gene demonstrates the integrity and processivity of the reverse transcription reaction which ensures full-length cDNA.
cDNA Libraries
Is it possible to transfer a Gateway-compatible cDNA library with minimal loss of average insert size or number of clones?
Yes, the Gateway LR reaction allows you to transfer a cDNA library made in Gateway entry vectors into Gateway destination vectors with no significant effect on the library's average insert size or insert size range. Thus, the library's complexity is maintained after the LR reaction. The library transfer reaction protocol is found in the CloneMiner™ II cDNA Library Construction Kit manual.
What is the best way to transfer a cDNA library without att sites into a Gateway vector to generate a Gateway library?
There is no recommended method that would maintain the complexity of the original library. The best option is to create a new library using the CloneMiner™ II cDNA Library Construction Kit. This kit will allow you to clone, via a BP reaction, all the generated cDNAs into a Gateway-compatible vector.
If a cDNA library is made in a lambda vector, is it Gateway-compatible?
It depends on whether the lambda vector has recombination (att) sites that are compatible with the design of our system. Without att sites, the library would definitely not be Gateway-compatible.
Can I transfect an amplified SuperScript cDNA library directly into eukaryotic cells?
Yes, but the pCMVSport vector does not have a eukaryotic origin of replication or selectable marker, so you can only screen for transient expression.
Do Invitrogen™ cDNA libraries contain attB or attL sites?
It depends upon the library. Only libraries in pCMVSport6 or pCMVSport6.1 have attB sequences.
Which promoter, T7 or SP6, should be used for an in vitro transcription/translation of clones in the pCMVSport vectors from Invitrogen™ Pre-made cDNA Libraries?
The cDNA insert is cloned in the Not I/Sal I sites of the pCMVSport vectors. The Sal I site is the 5' end of the sense strand. Therefore, in order to make an in vitro transcribed/translated product from the sense strand, one would have to use the SP6 promoter.
Why are oligo(dT)-primed cDNA libraries such as SuperScript II Pre-made Libraries and their clones not recommended for cloning into pLenti expression vectors?
Inserts cloned into lentiviral vectors should not have a poly(A) signal. The native poly(A) signal (AATAAA or something similar) will be amplified when using the oligo(dT) during cDNA synthesis. Thus, it will then become part of the cDNA library or its clones.Since lentivirus is an RNA virus, during the synthesis of the RNA genome to be packaged, if there is a polyadenylation [poly(A)] signal in the insert, the RNA will be terminated prematurely. Almost any clone transferred from a Gateway cDNA library will probably have a poly(A) signal, which, if inserted into a lentiviral vector, would end up terminating the viral RNA prematurely.In order to circumvent premature termination of the lentiviral RNA, consider these recommendations:The desired gene should first be isolated from the library, cloned into an entry vector such as pENTR™/D-TOPO without the poly(A) signal (i.e., ATG to stop), and then transferred into the lentiviral vector.If you are trying to establish a lentiviral expression library, you will probably have to go with a library that was amplified using random hexamers rather than an oligo(dT), since such a library would be less likely to include a poly(A) signal in the insert.Size is not usually a problem. The insert size limit of lentivirus is ~5–6 kb (average insert size of the SuperScript II Pre-made Libraries is ~1.5 kb).
How do you recommend that I amplify my plasmid library to minimize risk of representational bias?
Semisolid amplification of primary cDNA transformants minimizes representational biases that can occur during the expansion of plasmid cDNA libraries. We also recommend performing amplification at 30°C, which helps to stabilize unstable clones. See below for a detailed protocol.CAUTION: Bottles of semisolid agar containing suspended colonies must be handled gently and incubated without disturbance. Rough handling or bumping of the incubator will cause microcolonies to fall out of solution. Incubators that have fans can cause colonies to fall out of solution.Recommended Procedure:Prepare 2.0 L of 2X LB. Remove 200 mL of the 2X LB to make the 2X LB Glycerol (see below).Place a large stir bar and 1.35 g SeaPrep (FMC) agarose into each of four 500 mL autoclavable bottles. Place bottles on stir plates. With the stir plate turned on, add 450 mL of 2X LB to each bottle (avoid the formation of large clumps of agarose).Autoclave these bottles of 2X LB agarose for 30 min.Cool bottles in 37°C water bath for ~2 hr until media reaches 37°C.After the media reaches 37°C, add the appropriate selection antibiotic. For ampicillin resistance markers, add carbenicillin to 50 µg/mL (preferred) OR ampicillin 200 µg/mL. Mix on stir plate. (Carbenicillin reduces satellite formation.)To each bottle, add 4 x 105–6 x 105 primary cDNA transformants (colonies from original library), and mix thoroughly on a stir plate for 2 min. Tighten caps.Place bottles in an ice water bath (0°C) such that the level of water in the bath is at the same level as the upper level of media in the bottle. Incubate 1 hr in the ice bath.Gently remove bottles from ice bath and wipe the water off the outside of the bottles. Loosen bottle caps. Place these bottles in a gravity flow incubator set at 30°C.Incubate these bottles for 40–45 hr without disturbance. Place a Sorvall GSA Rotor at room temperature the morning of harvest.Pour contents of bottles into Sorvall GSA bottles and centrifuge at 8,000 rpm for 20 min at room temperature (Caution: Make sure that the rotor was set at room temperature for at least two hours before adding the Sorvall GSA bottles. Rotors at 4°C will cause solidification of agar.)Pour off supernatant.Resuspend the cells in a total volume of 100 mL 2X LB Glycerol (12.5%). Remove two 100 µL aliquots for plating, further analysis, and colony estimate. Cells can be filtered through sterile cheesecloth to remove agarose clumps if present.Subdivide the cells into ~10 mL aliquots (Note: It is useful to make a number of 1 mL and 100 µL aliquots.) and place at -70°C. Store at -70°C.Frozen cells can then further amplified in liquid at 30°C to obtain DNA. Use 2.5 x 109 cells per 100 mL growth medium for further expansion of library.2 X LB Recipe: 20 g Tryptone 10 g Yeast Extract 10 g NaCl Bring to 1,000 mL with H2O.2 X LB Glycerol (12.5%) Recipe: 175 mL 2 X LB 25 mL Glycerol (100%) Filter sterilize and store for up to two months at room temperature.Reference: Kriegler M (1990) Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual. Stockton Press, New York, NY. Hanahan D, Jessee J, and Bloom FR (1991) Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol 204:63-113.For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.Need more information? Contact us ›
Ordering
Plus Icon
Minus Icon
Order Status
Order Help
Quick Order
Supply Center
eProcurement
Support
Plus Icon
Minus Icon
Help and Support
Contact Us
Technical Support Centers
Documents and Certificates
Report a Site Issue
Resources
Plus Icon
Minus Icon
Learning Centers
Promotions
Events and Webinars
Social Media
About Thermo Fisher
Plus Icon
Minus Icon
About Us
Careers
Investors
News
Social Responsibility
Trademarks
Our Portfolio
Plus Icon
Minus Icon
Thermo Scientific
Applied Biosystems
Invitrogen
Gibco
Ion Torrent
Fisher Scientific
Unity Lab Services
Patheon
PPD
Terms & Conditions
Privacy Policy
Price & Freight Policy
© Copyright 2006-2024 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved
Philippines
一种适用于链霉菌异源合成基因簇同框缺失的高效方法
一种适用于链霉菌异源合成基因簇同框缺失的高效方法
微生物学通报 2022, Vol. 49 Issue (9): 3657−3670
扩展功能
把本文推荐给朋友
加入我的书架
加入引用管理器
Email Alert
RSS
文章信息
林琛, 罗祥坤, 邓子新, 贺新义
LIN Chen, LUO Xiangkun, DENG Zixin, HE Xinyi
一种适用于链霉菌异源合成基因簇同框缺失的高效方法
An efficient method for in-frame deletion of heterologous synthetic gene clusters in Streptomyces
微生物学通报, 2022, 49(9): 3657-3670
Microbiology China, 2022, 49(9): 3657-3670
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.220080
文章历史
收稿日期: 2022-01-21
接受日期: 2022-03-03
网络首发日期: 2022-04-12
Abstract
Figures
Tables
引用本文 0
林琛, 罗祥坤, 邓子新, 贺新义. 一种适用于链霉菌异源合成基因簇同框缺失的高效方法[J]. 微生物学通报, 2022, 49(9): 3657-3670.
LIN Chen, LUO Xiangkun, DENG Zixin, HE Xinyi. An efficient method for in-frame deletion of heterologous synthetic gene clusters in Streptomyces[J]. Microbiology China, 2022, 49(9): 3657-3670.
一种适用于链霉菌异源合成基因簇同框缺失的高效方法
林琛
,
罗祥坤
,
邓子新
,
贺新义
上海交通大学生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室，上海 200030
收稿日期: 2022-01-21; 接受日期: 2022-03-03; 网络首发日期: 2022-04-12
基金项目: 国家重点研发计划(2018YFA0901200)
摘要: 【背景】 对抗生素生物合成途径的阐明有助于提高目标化合物的产量并开发具有更高活性的新化合物。基因的同框缺失是天然产物生物合成研究的常规手段，通过分析突变菌株积累的中间产物，可以帮助推导天然产物的合成途径及相关基因的功能。天然产物生物合成基因簇的大小一般在20 kb以上，对每个基因进行同框缺失耗时耗力，因此，优化链霉菌来源的基因同框缺失的方法有重要的意义。【目的】 基于PCR-targeting重新设计了一套在链霉菌柯斯文库质粒上进行基因同框缺失的方法，实现链霉菌基因在大肠杆菌中快速、高效的基因同框缺失的技术体系。【方法】 使用氨苄青霉素抗性基因bla作为PCR-targeting DNA片段的筛选标记，同时使用体外的Pac I酶切和酶连系统代替体内的Flp/FRT系统来介导同框缺失的构建。【结果】 利用这种方法，在6 d内完成了米多霉素生物合成基因簇中14个基因的同框缺失。【结论】 此方法与传统的PCR-targeting方法相比，构建同框缺失载体的效率明显提高；Pac I识别序列在链霉菌基因组上的稀有性使得此方法在构建抗生素生物合成基因簇必需基因的同框缺失载体上具有普适性。
关键词:
链霉菌 PCR-targeting 同框缺失 米多霉素
An efficient method for in-frame deletion of heterologous synthetic gene clusters in Streptomyces
LIN Chen
,
LUO Xiangkun
,
DENG Zixin
,
HE Xinyi
State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China
Received: 21-01-2022; Accepted: 03-03-2022; Published online: 12-04-2022
Foundation item: National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901200)
*Corresponding author:
HE Xinyi, E-mail: xyhe@sjtu.edu.cn.
Abstract: [Background] Elucidation of antibiotic biosynthetic pathways can help improve the yields of target compounds and create new compounds with more effectiveness. In-frame deletion of genes is a routine method in the study of natural product biosynthesis. By analyzing the intermediate products accumulated by mutant strains, we can deduce the synthetic pathways of natural products and the functions of involving genes. The biosynthetic gene clusters for natural products are generally more than 20 kb in size, which make the in-frame deletion of each gene time-consuming and labor-intensive. Therefore, it is of great significance to optimize the method for in-frame deletion of genes derived from Streptomyces. [Objective] On the basis of the principle of PCR-targeting, we redesigned a method for gene in-frame deletion in cosmids from Streptomyces gene library and established a technical system for rapid and high-precision in-frame deletion of Streptomyces genes in Escherichia coli. [Methods] We used the ampicillin resistance gene bla as a marker for the screening of PCR-targeting DNA fragments and replaced the in vivo Flp/FRT system by the in vitro Pac I digestion and ligation system to mediate the construction of in-frame deletion vectors. [Results] Using this method, we completed the in-frame deletion of 14 genes in the mildiomycin biosynthetic gene cluster within 6 days. [Conclusion] Compared with the traditional PCR-targeting method, the established method demonstrates improved efficiency of constructing in-frame deletion vectors. The rarity of the Pac I recognition sequence in the Streptomyces genome makes this method universal for constructing in-frame deletion vectors of essential genes in antibiotic biosynthesis gene clusters.
Keywords:
Streptomyces PCR-targeting in-frame deletion mildiomycin
链霉菌是土壤中重要的微生物类群，其因具有复杂的形态分化并能够产生丰富的活性天然产物而被人们所熟知和研究。据统计，自然界中约有三分之二的已知抗生素从链霉菌中被分离和发现[1]。此外，链霉菌还是生物界中GC含量最高的物种之一，基因组平均GC含量高达74%[2]，有些次级代谢生物合成基因簇的GC含量甚至接近90%[3]。参与抗生素生物合成的基因总是成簇排列，抗生素完整生物合成基因簇的克隆及生物合成机制的阐明，是合成生物学策略创造具有新生物活性“非天然化合物”的基础[4-5]，也有助于解决目前所面临的细菌耐药性不断增加和抗生素生物合成产量低下的难题。研究抗生素生物合成机制的常规手段是对其生物合成基因簇中的必需基因分别进行突变，根据突变株积累的中间产物来推断抗生素的生物合成途径。 在原核生物中，抗生素生物合成基因簇的基因往往以操纵子的形式存在，抗性基因的插入突变在很多情形下会造成极性效应，同时引起目标基因和下游基因的功能失活，不利于研究某一特定基因在生物合成途径中的真正功能。为了排除极性效应的影响，解决方法是对靶标基因分别进行同框缺失。然而抗生素生物合成基因簇大小一般在20−200 kb范围内[6]，簇内包含的开放阅读框(open reading frame，ORF)数量多达十几甚至几十个，对它们分别进行同框缺失耗时耗力，如何快速和高效地构建抗生素生物合成必需基因的同框缺失载体对研究抗生素的生物合成途径具有重要意义。 目前，对链霉菌进行基因同框缺失的常见方法根据操作对象的不同可分为两类：(1) 以链霉菌染色体上的基因为对象，这需要宿主链霉菌具有高效的遗传操作体系。传统的方法是利用自杀质粒(如温敏型质粒pKC1139[7])通过同源双交换的方法来介导基因的同框缺失，但是这种方法的效率很低，费时费力。为了进一步提高构建效率，人们陆续引入了位点特异性重组的Cre/loxp[8]、归位内切酶的I-Sce I[9]等系统，先是通过同源重组的方式将含有筛选标记(抗性基因)和功能识别位点的载体整合到链霉菌的基因组上，然后往链霉菌中导入蛋白表达载体并诱导表达，把筛选标记和目标基因给抹去，最终达到同框缺失的目的，但是这种方法的操作周期很长(因为链霉菌生长周期很长，接种到产孢往往需要7 d以上)且操作烦琐(需要2次将载体导入链霉菌中)；直到最近，CRISPR-Cas9[10]系统在链霉菌上的成功应用才一定程度上弥补了上述不足。(2) 以含有合成特定天然产物基因簇的柯斯质粒或BAC质粒上的基因为对象，适合构建有柯斯质粒或BAC质粒文库的遗传操作困难的非模式链霉菌。一般使用PCR-targeting方法[11]来介导目标基因的同框缺失，其主要原理是：先使用设计好的引物扩增出两端带有同源臂且包含一个特定的筛选标记(抗性基因)的DNA线性片段；然后通过诱导λ RED重组酶把线性片段上的筛选标记替换靶标基因，实现基因敲除；最后，通过诱导Flp/FRT位点特异性重组系统进行目标基因的同框缺失，其会将2个FRT (Flp识别靶点)之间的选择性标记基因抹去，留下81 bp的“疤痕” (图 1)。
图 1 PCR-targeting的操作流程示意图[11]
Figure 1 Schematic diagram of the operation flow of PCR-targeting[11].
图选项
PCR-targeting方法中进行同框缺失所使用的Flp/FRT系统是一种来源于酵母位点特异性的重组系统，由于其重组过程中的可逆性导致了重组效率的低下[12]。同时这个系统是在细胞体内操作的，其操作时长受限于细胞的生长周期。为了摆脱这方面的影响，可以用稀有的酶切位点来替代FRT的序列，前提是柯斯质粒和BAC文库质粒上无该酶的识别位点。在获得抗性敲入的质粒后，直接在体外用酶切酶连的方式获得基因同框缺失的载体，通过接合转移的方法导入到链霉菌中进行(异源)表达，分析菌株的代谢产物来研究相关的生物合成途径和基因的功能。 以往所有基于PCR-targeting的基因缺失载体的构建设计中，选择的抗性基因主要针对的是氨基糖苷类抗生素，因为这些抗性基因既能够在大肠杆菌中表达，也能在链霉菌中表达，可以在两种宿主菌中作为筛选标记进行筛选，例如aac(3)IV (阿伯拉霉素抗性基因)、aadA (壮观霉素/链霉素抗性基因)和vph (紫霉素抗性基因)。氨基糖苷类抗生素的作用机制是与细菌的核糖体结合进而抑制蛋白质的合成[13]。然而，氨基糖苷类抗生素由于抗性机制的类似性，会出现抗性的交叉干扰。因此在进行多基因敲除时，同时使用不同氨基糖苷类抗生素抗性基因作为筛选标记，假阳性会大大提高。另外，氨基糖苷类抗生素长时间在37 ℃培养条件下容易失效，导致假阳性菌株的生长。氨苄青霉素是一种β-内酰胺类抗生素，其抗性机制是通过抑制胞壁粘肽合成酶从而抑制细菌细胞壁的合成来达到抑菌效果[14]，使用它不仅能够避开氨基糖苷类抗生素抗性基因的影响，而且在37 ℃条件下筛菌只会出现卫星菌落而不出现假阳性菌落。 本研究选取氨苄青霉素抗性基因bla作为PCR-targeting的筛选标记，在链霉菌柯斯质粒上直接进行基因敲除，大大降低了使用氨基糖苷类抗生素筛选出现假阳性克隆的风险。为了进一步缩短同框缺失载体的构建时间，我们把同框缺失的过程由体内转移到体外，采用体外酶切酶连的方式代替体内的Flp/FRT系统，同时在bla的两侧各引入一个Pac Ⅰ位点(5′-TTAATTAA-3′)，通过酶切自连以期获得用于异源表达的基因同框缺失载体。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒
研究所用的菌株为大肠杆菌DH10B、BW25113/pIJ790[11]，由上海交通大学分子微生物学实验室保存。 研究所用的质粒pETDuet-1和柯斯质粒14A6[15]来自实验室，由pSET152和pOJ446组装成的pJTU2554衍生而来，内含有完整的米多霉素生物合成基因簇，而且具有阿伯拉霉素抗性基因aac(3)IV、attP、oriT等可在链霉菌中进行穿梭与整合的关键元件。
1.1.2 培养基[16]
LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，蒸馏水定容至1 000 mL，1×105 Pa灭菌30 min；LB固体培养基：在LB液体培养基中加入15g/L的琼脂粉；YENB液体培养基(g/L)：牛肉浸膏提取物3.0，胰蛋白胨5.0，酵母提取物7.5，蒸馏水定容至1 000 mL，1×105 Pa灭菌30 min。 质粒提取试剂：Solution Ⅰ：葡萄糖50 mmol/L，Tris-HCl (pH 8.0) 25 mmol/L, EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L；Solution Ⅱ：NaOH 0.2 mol/L，SDS溶液10 g/L；Solution Ⅲ：乙酸钾(pH 4.8) 2.55 mol/L；核酸脱盐胶：葡萄糖100 mmol/L，琼脂糖10 g/L。
1.1.3 PCR-targeting所用引物
研究中PCR-targeting所用的引物见表 1。
表 1 本研究所用PCR-targeting的引物信息
Table 1 Information of the primers used for PCR-targeting in this study
引物名称Primer name
序列Sequences (5′→3′)
同源臂序列GC含量The GC content of homologous arm sequences (%)
两同源臂GC含量平均值The average GC content of two homologous arm sequences (%)
两同源臂GC含量Δ值The Δ value of GC content of two homologous sequences
milD-PT-F
cgccggtccgggcgcgctgagggagagaaggaagcgatgTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
72
68.5
7
milD-PT-R
cgcacctcggagatctcgccgcaggtcatcgccgtgtcaaTTAATTAAGAAGATCCTTTGATCTTTTC
65
milE-PT-F
acgccgtcgtggcgctgctcaagggatgacacggcgatgTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
67
70.5
7
milE-PT-R
ggatcagcggctcggccgccggactccggtcaggcaacgTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
74
milF-PT-F
ggccggggctgtcccgggggaggtggaccgttgcctgacTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
77
79.5
5
milF-PT-R
ggccgcccgtcgcgggccccgtcgcggggtgcgtcatgaTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
82
milG-PT-F
acgcaccccgcgacggggcccgcgacgggcggccgtgacTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
85
81.0
8
milG-PT-R
gacggggcgtgcgagcaaagggcgtggcgccccggtcagTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
77
milH-PT-F
ccgcccgcacgtcatcctccgcccaggaagccgaacatgTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
69
69.0
0
milH-PT-R
cgtgggtccggtggtcggtccggtcgtaggtgctgtcacTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
69
milI-PT-F
acccgtcggcccgagcgacgaggacggtgcgctgtgacaTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
72
73.0
2
milI-PT-R
cgatccgtccacccggatggccgtgccccccacgctcacTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
74
milJ-PT-F
cggcgtcgaccggctcgcctcgctgggggtgatctgatgTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
72
74.5
5
milJ-PT-R
gcgcccgccgaggacggctccggtccggggcgttctcatTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
77
milK-PT-F
gatcgaagacttccacgacccggcgggagaccgatgagaTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
62
62.0
0
milK-PT-R
gagacggggagtcagccctggtggtcatggtgttctcacTTAATTAAGAAGATCCTTTGATCTTTTC
62
milL-PT-F
cacccgacaccaccacgacgggagtgtgagaacaccatgTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
62
64.5
5
milL-PT-R
cgtctcaagggacgtgacaggacccgccggacggttcagTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
67
milM-PT-F
cctccggggcgtcccccacgcaaaggtatggatggcatgTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
67
68.0
2
milM-PT-R
gggtgaccagcggagcgatgaggccgggctcacgcatagTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
69
milN-PT-F
tggcccggctgcggacgcttctcgcccgctatgcgtgagTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
72
64.0
16
milN-PT-R
attcatggtcactcccatttccgtacggtggggggtcacTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
56
milO-PT-F
cccgcgccgccaggcgcgggaaaccccacggcgggtcagTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
82
82.0
0
milO-PT-R
ggtggagggcgccgggcaggccggccgatgaccggcgtgTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
82
milP-PT-F
ggtcagccgggcctccgtcagggggcacacgccggtcatTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
74
66.5
15
milP-PT-R
ctcttcgaagacgtctccttcagagtgggcgagggcatgTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
59
milQ-PT-F
cccgttcggggggcccgtttcccgtagggtggacgcgtgTTAATTAATTACCAATGCTTAATCAGTG
74
79.5
11
milQ-PT-R
ccccaccccgcccccgccccacccaccgggcccgctcatTTAATTAATTAGCAGAGCGAGGTATGTA
85
注：Pac Ⅰ识别序列用下划线标注；同源臂部分用小写字母表示；Δ值代表差值的绝对值Note: The Pac Ⅰ recognition sequences is underlined; the homology arm sequences is indicated by lowercase letters; Δ value is the sum of absolute difference.
表选项
1.1.4 验证用引物
研究中验证所用的引物见表 2。
表 2 本研究所用的验证引物信息
Table 2 Information of primer used for mutant validation in this study
引物名称Primer name
序列Sequence (5′→3′)
14A6扩增片段大小The fragment length amplified with 14A6 vector (bp)
14A6敲除突变扩增片段大小The fragment length amplified with 14A6 disrupted mutation vector (bp)
14A6同框缺失扩增片段大小The fragment length amplified with 14A6 in-frame deletion vector (bp)
milA-con-F
AGTGATGGAAACCCATACGTTC
1 032
−
−
milA-con-R
CCGAGGTCAGGAGCCGATC
milD-con-F
AATCGCAGGGACGGATCACC
1 361
1 224
181
milD-con-R
GCAGTTCCCGTTCTCCCTGA
milE-con-F
CGACTGGCTGGTCGAGGCGATGGTC
1 395
1 857
594
milE-con-R
GCGGCAGCACGCGTCGAGGAAACCG
milF-con-F
CACGGCGACTTCCGCACGCCCAACC
930
1 779
516
milF-con-R
ACCGGACGTATCGCACGCCCGACTCC
milG-con-F
TCTCGGGCCACCCGGACGTCACCCG
1 331
1 640
377
milG-con-R
ACCAGCGGGTCACCAGCACGTCCAGC
milH-con-F
GCACGCCGAGGAGTTCAAGCAGCAG
2 644
1 699
436
milH-con-R
CGAGTCGAGCGAGCCGAAGAGCGCGT
milI-con-F
ATGCAGTGCGGGGACTACGCCCAGG
1 793
1 991
728
milI-con-R
AACACCGTGCAGCCCTAGGCCCTCCC
milJ-con-F
AGCTCGAATGGCTGCTGGAACTCGAC
1 280
1 604
341
milJ-con-R
AGCAGGAAGAGGACGAACACGCCCC
milK-con-F
GTCCCTGTGGGTGACGGAAGGCGTGC
1 877
1 608
566
milK-con-R
CACCGGACCGCCCGAAGACGATCAC
milL-con-F
CTGTCGACCAGCGTGCTCACCTTCGC
1 458
1 749
486
milL-con-R
GCAGGGAGTCCACGATGAGCTGCTGG
milM-con-F
CGGCGGGTCCTGTCACGTCCCTTGAG
1 331
1 425
162
milM-con-R
GCGCCCGTACGCACGCTTCCGAGAC
milN-con-F
TCCGGCCACGGCATCCACGTCCTGC
1 149
1 656
393
milN-con-R
GATCAGCGCGGCCACCCGGTCAAGC
milO-con-F
GGCTGATCTCTTCGCGGTGCCTGCCT
1 553
1 760
497
milO-con-R
CCAACAGGCCCGCTTCCTCATCCTCC
milP-con-F
CCCGCGGTCCGTGTGCTGGATCAGG
2 094
1 791
528
milP-con-R
CACGCGTCCACCCTACGGGAAACGG
milQ-con-F
GGCTCTTGATCTCGTGTGCGCCAG
1 125
1 632
369
milQ-con-R
CTGAAGGCAGGCACCGCGAAGAGC
Note: -: No data.
表选项
1.1.5 主要试剂和仪器
PCR试剂和DNA连接酶，TaKaRa公司；Pac Ⅰ限制性内切酶，NEB公司；胶回收试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司。PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司；电转化仪，Bio-Rad公司。 1.2 方法
1.2.1 普通电转感受态细胞的制备
对保存的BW25113/pIJ790在LB平板上进行划线活化，然后挑取单菌落于3 mL的LB液体培养基中30 ℃、200 r/min培养过夜，以1:100的比例将上述菌液接入200 mL的LB培养基中并于30 ℃、200 r/min培养至菌液的OD600为0.6。然后将菌液置于冰上冷却15 min，随后于预冷的离心机上3 500 r/min离心10 min，弃上清；之后用10 mL预冷的10%甘油轻柔地重悬菌体，3 500 r/min离心10 min，弃上清；重复上述步骤；最后向清洗好的菌体中加入适量预冷的10%甘油重悬菌体并进行分装，置于−80 ℃的冰箱中保存。
1.2.2 电转化
从−80 ℃冰箱中取出电转感受态/高效电转感受态细胞于冰上化冻，加入适量预冷的质粒，轻弹混匀后转入预冷的电转杯中，根据电转杯的厚度选取合适的电压(1 mm：1 800 V；2 mm：2 500 V)和电阻，于电转仪中进行电击；电转结束后迅速加入预冷的1 mL LB培养基，然后在30 ℃、220 r/min的恒温摇床上预培养40 min，最后均匀地涂布于含有相应抗生素的LB平板上，吹干后倒置于37 ℃恒温培养箱中培养过夜。
1.2.3 高效电转感受态细胞的制备
挑取BW25113/pIJ790/14A6单菌落于3 mL LB液体培养基，30 ℃、200 r/min培养过夜，按照1:100的比例将上述菌液接入200 mL YENB培养基中，同时加入浓度为1 mol/L的阿拉伯糖2 mL (至终浓度为10 mmol/L)，在摇床中培养约3 h至菌液OD600的值约为0.5，再加入浓度为2 mol/L的MgCl2或MgSO4 1 mL (至终浓度为10 mmol/L)，在摇床中继续培养10 min后于水浴锅中42 ℃热激3 min，再置于摇床中30 ℃、220 r/min培养20 min。得到培养好的菌液后，接下来的处理与方法1.2.1相同。
1.2.4 质粒提取
取2−3 mL培养过夜的菌液于12 000 r/min离心1 min收集菌体。弃上清后加入150 μL的溶液Ⅰ并充分振荡重悬菌体，然后加入400 μL的溶液Ⅱ，轻柔混匀8−10次，待溶液变澄清后加入350 μL的溶液Ⅲ进行中和，轻柔振荡混匀。随后加入500 μL的氯仿，充分振荡混匀后，于12 000 r/min离心10 min，取上清于另一干净离心管中。加入等体积的异丙醇，充分振荡混匀后于冰上放置15−20 min，然后于4 ℃预冷的离心机中12 000 r/min离心10 min收集沉淀。往DNA沉淀中加入600 μL 75%乙醇清洗2次，并置于70 ℃烘箱中5 min使乙醇完全挥发，最后加入50 μL ddH2O溶解DNA。
1.2.5 酶切、盐沉、酶连与脱盐
(1) 酶切：本研究特指用Pac Ⅰ酶切抗性基因插入后的柯斯质粒。根据产品说明书，配制了100 μL的反应体系，在37 ℃的条件下反应3 h。 (2) 盐沉：向反应完成的酶切体系中加入1/10体积的3 mol/L乙酸钾，充分混匀；后加入等体积的异丙醇，充分混匀后置于冰上冷却30 min，然后于预冷的离心机中12 000 r/min离心10 min收集沉淀；之后使用500 μL 75%乙醇清洗DNA沉淀2次，于70 ℃烘箱中放置10 min使乙醇挥发，最后加入30 μL ddH2O对DNA沉淀进行溶解。 (3) 酶连：根据产品说明书，配制10 μL的反应体系，在16 ℃反应3 h。 (4) 脱盐：吸取1 mL脱盐胶至1.5 mL离心管中，并往胶中插入PCR管；待脱盐胶凝固后小心拔出PCR管；将酶连完成的体系小心吸取至管洞内，后将脱盐胶放于4 ℃条件下静置1 h，即脱盐完成，脱盐完成的酶连体系即可进行后续的电转化。 2 结果与分析
2.1 氨基糖苷类抗生素与氨苄青霉素在转化子筛选时的稳定性比较
为了验证在前言中提到的两类抗生素的稳定性，我们比较了常见的氨基糖苷类抗生素(壮观霉素、阿伯拉霉素)和氨苄青霉素在筛选转化子方面的差异性。转化了pET44b(bla)质粒的大肠杆菌DH10B在含壮观霉素和阿伯拉霉素LB平板以及转化了pCDF-Duet(aadA)质粒的大肠杆菌DH10B在含阿伯拉霉素和氨苄青霉素LB平板，在37 ℃培养12 h后均无单菌落生长，这说明所使用的抗生素是有效的(图 2A)。但是随着培养时间增加到30 h，转化了pET44b(bla)质粒的大肠杆菌DH10B在含壮观霉素和阿伯拉霉素LA平板以及转化了pCDF-Duet(aadA)质粒的大肠杆菌DH10B在含阿伯拉霉素平板上出现了较多的假阳性菌落(图 2B)，但转化了pCDF-Duet(aadA)质粒的大肠杆菌DH10B在含氨苄青霉素平板上未出现假阳性菌落(图 2B)。这充分说明在筛选转化子时氨苄青霉素比另外2种常用的氨基糖苷类抗生素更加可靠和稳定。
图 2 含pET44b(bla)和pCDF-Duet(aadA)的E. coli DH10B转化子不同抗生素平板下的生长情况
Figure 2 Growth of E. coli DH10B transformants with pET44b(bla) and pCDF-Duet(aadA) under different antibiotic plates.
bla：氨苄青霉素抗性基因；aadA：壮观霉素抗性基因
Bla: Ampicillin resistance gene; aadA: Spectinomycin resistance gene.
图选项
2.2 同框缺失引物的设计逻辑
使用SnapGene软件进行序列比对，发现本实验中用到的柯斯质粒14A6 (米多霉素生物合成基因簇)不含有Pac Ⅰ的识别位点(5′-TTAATTAA-3′)；同时实验室中常见的模式链霉菌如天蓝色链霉菌[Streptomyces ceolicolor A3(2)]、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans TK24)、白色链霉菌(Streptomyces albus NBRC 13014)和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis MA4680)的基因组上也均不存在Pac Ⅰ的识别位点，这说明利用PCR引入Pac Ⅰ位点对链霉菌来源的基因簇进行同框缺失具有普适性。 由于Pac Ⅰ酶切位点是8个碱基，为了达到同框的目的，需要再补充一个额外的碱基使得酶切酶连后留下“疤痕”的长度为9个碱基(3的倍数)。这个额外的碱基加在Pac Ⅰ酶切位点的5′端，形成5′-NTTAATTAA-3′，此序列的最后一个三联体密码子是终止密码子(TAA)。因此这个额外的碱基加在Pac Ⅰ酶切位点的3′端来避免上述问题，形成5′-TTAATTAAN-3′。 14A6衍生于pJTU2554且包含了完整的米多霉素生物合成基因簇[15]，由于该载体上包含了oriT序列(大肠杆菌向链霉菌接合转移起始位点)，我们在扩增氨苄青霉素的抗性基因bla时，可以略去oriT序列。综合上述信息，设计了milD至milQ的PCR-targeting引物(序列如表 1所示)，并以pETDuet-1质粒(含有氨苄青霉素抗性基因bla)为模板进行PCR扩增得到氨苄青霉素抗性标记的基因盒。同时，为了方便后面的PCR检测，在设计同框缺失时，尽量使插入的基因盒(同源序列-Pac Ⅰ位点-bla-Pac Ⅰ位点-同源序列)和缺失片段的长度有较大区别，以利于后续的验证观察。因此设计了两种大小的插入基因盒，其中插入基因盒1的长度为1 050 bp (图 3)，用来替换milD (1 188 bp)和milK (1 329 bp)；而插入基因盒2的长度为1 271 bp，用来替换milE (822 bp)、milF (474 bp)、milG (1008 bp)、milH (2 223 bp)、milI (1 083 bp)、milJ (954 bp)、milL (987 bp)、milM (1 170 bp)、milN (777 bp)、milO (1 071 bp)、milP (1 584 bp)和milQ (771 bp)。
图 3 同框缺失引物的设计示意图(以milD的同框缺失引物设计为例)
Figure 3 Representation of primer design for gene in-frame deletion (Take the primer design of in-frame deletion of milD as an example).
N：ATCG四种碱基中的一种；扩增bla抗性基因的DNA模板是pETDuet-1的质粒DNA；灰色箭头：在Pac Ⅰ酶切位点后加上一个碱基
N: One of the four bases of ATCG; the DNA template for amplifying the bla resistance gene is the plasmid DNA of pETDuet-1; Gray arrow: A base is added after the Pac Ⅰ restriction site.
图选项
2.3 柯斯质粒14A6上米多霉素生物合成基因抗性插入突变
把包含完整米多霉素生物合成基因簇的柯斯质粒14A6转入到大肠杆菌BW25113/pIJ790，中。pIJ790表达λ RED重组酶，可以介导DNA线性片段与质粒或染色体同源片段之间的重组。将菌株BW25113/pIJ790/14A6制备成电转感受态细胞。然后把扩增得到的带有bla的基因盒1或基因盒2导入到该感受态细胞中(图 4A)，通过氨苄青霉素筛选和PCR扩增验证(验证引物序列如表 2所示)，在14A6上，对milD至milQ进行了单基因的bla插入突变。
图 4 米多霉素生物合成基因敲除突变载体的构建与PCR验证
Figure 4 Construction and PCR validation of mildiomycin biosynthesis gene knockout mutation vector.
凝胶图片展示的是PCR扩增检测的DNA片段；图片上方的数字代表不同的氨苄青霉素抗性菌落；14A6：初始柯斯质粒DNA模板，作为参照；M：DNA分子量标准
The gel picture shows the DNA fragments detected by PCR amplification; The numbers above the picture represent different ampicillin-resistant colonies; 14A6: The starting cosmid DNA template, as a reference; M: The DNA molecular weight standard.
图选项
2.4 米多霉素生物合成必需基因同框缺失载体的构建
提取米多霉素生物合成基因敲除突变质粒DNA后，再用Pac Ⅰ进行酶切消化后自连，酶连产物转化大肠杆菌DH10B后，挑取在含阿伯拉抗生素平板(14A6载体所带抗性基因)上长出来的单菌落进行PCR验证。利用上述方法，成功地在6 d内获得了milD至milQ的同框缺失载体(图 5B，部分结果)。
图 5 14A6上进行米多霉素生物合成基因同框缺失载体的构建与验证
Figure 5 Construction and validation of gene in-frame deletion on cosmid 14A6.
A：Pac Ⅰ酶切米多霉素合成基因上带有bla插入突变的14A6及自连；B：PCR验证bla丢失后的同框缺失载体
A: Schematic diagram of Pac Ⅰ digestion and ligation-mediated elimination of resistance genes; B: PCR verification of the milD−milQ in-frame deletion vector.
图选项
Pac Ⅰ酶切后再酶连会出现两种情况：一种是酶切出来的片段又重新连上载体，或者片段反转180度再连接回载体；另外一种是酶切后的载体自连。所需的目标载体是后一种，为了统计本方法获得酶切自连载体的比例，把酶连产物的转化菌株分别涂布在含阿伯拉和氨苄青霉素的LB平板上，统计发现得到自连同框缺失阳性克隆的比例非常高，阳性率为94.6%=(295–16)/295 (阿伯拉平板上菌落数为295，氨苄霉素平板上菌落数为16)，远高于体内FLP/FRT系统介导的40%同框缺失效率[17]。 3 讨论与结论
阿伯拉霉素是一种广谱抗生素，因其独特的结构能对大肠杆菌和链霉菌起作用且不易产生耐药性，被越来越广泛地用于链霉菌基因文库质粒的构建和筛选。然而阿伯拉霉素的抗性基因aac(3)IV对其他氨基糖苷类底物也可以起作用，其存在和表达会影响其他氨基糖苷类抗生素的效果[18]，使得后续操作中可供选择的替换片段的筛选标记变得十分有限。本方法选取了氨苄青霉素抗性基因bla作为基因插入替换的筛选标记，由于氨苄青霉素的抗性机制与阿伯拉霉素的抗性机制完全不同，避开了阿伯拉霉素抗性基因aac(3)IV的影响。同时，氨苄青霉素(β-内酰胺类抗生素)与阿伯拉霉素(氨基糖苷类抗生素)的联用所产生的协同效应会加强两者的药效[19]，从而减少氨苄青霉素耐药菌对阳性结果的干扰，提高了筛选阳性菌株的效率。本方法成功构建了米多霉素生物合成必需基因敲除突变载体，说明了bla基因作为替换片段中筛选标记的可行性，为含有阿伯拉抗性基因aac(3)IV的质粒进行同框缺失操作时提供了一个很好的备选方案。 其次，本方法选取了体外的Pac Ⅰ酶切和酶连体系代替了体内的FLP/FRT系统来介导载体的同框缺失，使得进行同框缺失载体的操作时不再受细胞生长周期的影响，提高了同框缺失载体的构建效率。Pac Ⅰ酶切识别位点(5′-TTAATTAA-3′)是个稀有的序列且不含GC碱基，其在GC含量最高物种——链霉菌基因组中出现的概率极低，减少了因链霉菌基因组中天然存在的Pac I位点对体外酶切干扰的概率，使得Pac Ⅰ体外酶切和酶连构建链霉菌基因同框缺失操作具有普适性。虽然I-Sce I的识别序列(5′-TAGGGATAACAGGGTAAT-3′)也满足上述要求，但是I-Sce I作为一种归位内切酶(homing endonucleases)，与一般Ⅱ型限制酶不同的是其识别序列并不严格[20-21]；此外，Pac Ⅰ识别位点的碱基数比I-Sce I位点少，这让引物的长度可以更短，合成成本更低。 在构建米多霉素生物合成必需基因的敲除突变载体过程中，不同基因被整合替换的效率不同，其中milD、milE、milH重组效率明显要高于milO、milP、milQ，通过分析milD−milQ的替换片段两端同源序列的GC平均含量及其GC含量的差异，替换片段两端同源序列的GC含量过高(80%)或过低(60%)及两臂GC含量的差异过大均会影响PCR-targeting的重组效率。构建同框缺失载体的最终目的是实现基因簇在链霉菌中的表达，分析被突变基因在体内的功能。本方法构建同框缺失载体是在体外进行并完成验证的，在后续接合转移所得到的接合子中，只需要验证质粒有无转进去即可，无需再次验证同框缺失的成功与否，这意味着后续各个同框缺失接合子的检测均无需局限于目标基因，而可以使用同一个引物来进行验证，更加符合高通量操作的需求。
REFERENCES
[1]
Zhang HR, Wang Y, Pfeifer BA. Bacterial hosts for natural product production[J]. Molecular Pharmaceutics, 2008, 5(2): 212-225. DOI:10.1021/mp7001329
[2]
Wright F, Bibb MJ. Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome[J]. Gene, 1992, 113(1): 55-65. DOI:10.1016/0378-1119(92)90669-G
[3]
Park HJ, Kim ES. An inducible Streptomyces gene cluster involved in aromatic compound metabolism[J]. FEMS Microbiology Letters, 2003, 226(1): 151-157. DOI:10.1016/S0378-1097(03)00585-8
[4]
Hopwood DA. Genetic contributions to understanding polyketide synthases[J]. Chemical Reviews, 1997, 97(7): 2465-2498. DOI:10.1021/cr960034i
[5]
Challis GL. Mining microbial genomes for new natural products and biosynthetic pathways[J]. Microbiology: Reading, England, 2008, 154(6): 1555-1569. DOI:10.1099/mic.0.2008/018523-0
[6]
Wang TT, Deng ZX, Chen WQ. Progress in strategies for cloning of antibiotics biosynthetic gene clusters[J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2016, 14(2): 70-74. (in Chinese) 王婷婷, 邓子新, 陈文青. 抗生素生物合成基因簇克隆策略的研究进展[J]. 生物加工过程, 2016, 14(2): 70-74.
[7]
Bierman M, Logan R, O'Brien K, Seno ET, Rao RN, Schoner BE. Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.[J]. Gene, 1992, 116(1): 43-49. DOI:10.1016/0378-1119(92)90627-2
[8]
Komatsu M, Uchiyama T, Omura S, Cane DE, Ikeda H. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism[J]. PNAS, 2010, 107(6): 2646-2651. DOI:10.1073/pnas.0914833107
[9]
Lu ZQ, Xie PF, Qin ZJ. Promotion of markerless deletion of the actinorhodin biosynthetic gene cluster in Streptomyces coelicolor[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2010, 42(10): 717-721. DOI:10.1093/abbs/gmq080
[10]
Cobb RE, Wang YJ, Zhao HM. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system[J]. ACS Synthetic Biology, 2015, 4(6): 723-728. DOI:10.1021/sb500351f
[11]
Gust B, Challis GL, Fowler K, Kieser T, Chater KF. PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin[J]. PNAS, 2003, 100(4): 1541-1546. DOI:10.1073/pnas.0337542100
[12]
Gu X, Li Y. The development of site-specific recombination[J]. Letters in Biotechnology, 2005, 16(4): 417-419. (in Chinese) 谷欣, 黎燕. 位点特异性重组技术研究进展[J]. 生物技术通讯, 2005, 16(4): 417-419.
[13]
Kotra LP, Haddad J, Mobashery S. Aminoglycosides: perspectives on mechanisms of action and resistance and strategies to counter resistance[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000, 44(12): 3249-3256. DOI:10.1128/AAC.44.12.3249-3256.2000
[14]
Waxman DJ, Strominger JL. Penicillin-binding proteins and the mechanism of action of beta-lactam antibiotics[J]. Annual Review of Biochemistry, 1983, 52: 825-869. DOI:10.1146/annurev.bi.52.070183.004141
[15]
Wu J, Li L, Deng ZX, Zabriskie TM, He XY. Analysis of the mildiomycin biosynthesis gene cluster in Streptoverticillum remofaciens ZJU5119 and characterization of MilC, a hydroxymethyl cytosyl-glucuronic acid synthase[J]. ChemBioChem, 2012, 13(11): 1613-1621. DOI:10.1002/cbic.201200173
[16]
Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ. Practical Streptomyces Genetics[M]. 2nd ed. Norwich: The John Innes Foundation, 2000.
[17]
Fedoryshyn M, Petzke L, Welle E, Bechthold A, Luzhetskyy A. Marker removal from actinomycetes genome using Flp recombinase[J]. Gene, 2008, 419(1/2): 43-47.
[18]
Magalhaes MLB, Blanchard JS. The kinetic mechanism of AAC3-Ⅳ aminoglycoside acetyltransferase from Escherichia coli[J]. Biochemistry, 2005, 44(49): 16275-16283. DOI:10.1021/bi051777d
[19]
Bliziotis IA, Samonis G, Vardakas KZ, Chrysanthopoulou S, Falagas ME. Effect of aminoglycoside and beta-lactam combination therapy versus beta-lactam monotherapy on the emergence of antimicrobial resistance: a meta-analysis of randomized, controlled trials[J]. Clinical Infectious Diseases, 2005, 41(2): 149-158. DOI:10.1086/430912
[20]
Gimble FS, Wang J. Substrate recognition and induced DNA distortion by the PI-SceI endonuclease, an enzyme generated by protein splicing[J]. Journal of Molecular Biology, 1996, 263(2): 163-180. DOI:10.1006/jmbi.1996.0567
[21]
Argast GM, Stephens KM, Emond MJ, Monnat RJ Jr. I-PpoI and I-CreI homing site sequence degeneracy determined by random mutagenesis and sequential in vitro enrichment[J]. Journal of Molecular Biology, 1998, 280(3): 345-353. DOI:10.1006/jmbi.1998.1886
百度知道 - 信息提示
百度知道 - 信息提示
百度首页
商城
注册
登录
网页
资讯
视频
图片
知道
文库
贴吧采购
地图更多
搜索答案
我要提问
百度知道>提示信息
知道宝贝找不到问题了>_
该问题可能已经失效。返回首页
15秒以后自动返回
帮助
| 意见反馈
| 投诉举报
京ICP证030173号-1 京网文【2023】1034-029号 ©2024Baidu 使用百度前必读 | 知道协议